1 前言

相对于100%循环利用的高炉渣，钢渣中的一部分没有再利用，进行了填埋处理。但由于最终处理场严重不足和填埋费用高昂，期待开发充分运用炉渣特性的新用法。在环境中利用炉渣，担心炉渣含有的环境监管金属泄漏，特别是在水域利用方面，有包括水质污染的各种环保法规的监管。

另一方面，炉渣含有许多生物必需的元素，例如钙和镁是生物需要量较多的常量元素，锌和铜是微量元素。对于炉渣，虽然规定了土壤和水质污染的重金属类溶出的试验方法，但实际上没有特别规定在水环境中炉渣溶出成分对接触生物的影响评估法。在最近的几项研究中，对生物的影响进行了评估。首先，用溶出试验化学性确认重金属类的溶出没有超过环境标准。然后，在实际水环境使用炉渣进行小规模试验，确认生物附着在炉渣上。通常，各元素的环境标准值是参考各个特定元素对生物影响的评估，设定该标准值。但不一定是像炉渣溶出成分那样多种元素同时接触的情况。因此，对于环境监管目标的个别元素，即使是在化学环境标准值以下，如果多种元素复合对生物发生作用，也可能给水域生态系统造成不可预期的负荷。因此，在研究水域利用炉渣时，不仅要与各种泄漏成分的环境标准比较，还要对其水域生态系统的影响进行评估。特别是为了避免水环境的现场试验造成水质污染，确立评估对水生生物影响的简易评估系统很重要。

本研究，作为水域利用电炉渣的基础研究的一环，进行了水域中电炉渣成分溶出及其溶出物对水生生物影响的评估。水生生物是支承水域生态系统的基础，本研究进行了对模型生物之一的植物小球藻影响的评估。关于炉渣溶出成分对小球藻增殖的影响，不仅分析了个体数量的变化，还从光合成生物的小球藻的光合成与增殖直接相关的二氧化碳浓度的角度进行了分析。

2 试验方法

2.1 使用的炉渣和炉渣成分溶出液

2.1.1 炉渣溶出试验及溶出液的制备

制备炉渣溶出液使用的是电炉普通钢渣和电炉不锈钢渣，表1是所用炉渣的化学成分。A渣是不锈钢渣，B渣是普通钢渣。A渣含SiO₂、 CaO、Cr₂O₃比B渣高，而FeO含量是B渣比A渣高。此外，不锈钢渣中含有不锈钢颗粒。因钢渣中的FeO和Cr₂O₃与不锈钢颗粒中的Fe和Cr不能区别，所以在此全部记为FeO和Cr₂O₃。

电炉渣成分溶出试验按照JIS K0058-1（炉渣中化学物质的试验方法——第一部分：溶出量试验方法）的规定进行。简要地说，是用盐酸制备为初始pH=6.0的纯水1L，加入粒径为1-2mm的氧化渣0.1kg。进行6h溶出后，用0.45μm的过滤器过滤，将滤液作为炉渣成分溶出液用于试验。

2.1.2 炉渣溶出成分的组成分析

炉渣溶出成分组成用电感耦合等离子发射光谱仪（ICPAES）和ICP质谱仪（ICP-MS）进行分析。此外，总氮量根据碱性过氧二硫酸钾法，将试样中的总氮化合物转换为硝酸。然后，用萨尔兹曼法测定硝酸盐的氮浓度。环境监管物质和其他微量元素的浓度测定依靠外部分析机构。

2.2 炉渣溶出成分存在下的小球藻增殖的评估

2.2.1 小球藻

使用小球藻评估了炉渣溶出成分对水生生物的影响。在浮游植物中，小球藻也作为细胞生物学的模型生物利用。本研究使用的小球藻是来自东京大学应用微生物学研究所的绿藻小球藻。

2.2.2 血球计算板法的评估

在一般浮游植物用的培养液中，添加对浮游植物增殖有用的成分，而炉渣溶出液中不含有该成分。因此，为了补充小球藻增殖所需的营养成分，在CA液体培养基（pH=7.2）

中，进行了小球藻增殖的试验，表2是CA培养基成分的浓度。含有炉渣溶出液的CA培养基的制备是，将表2所示值4倍浓度的CA培养基，装入试验容量的25vol%，再将炉渣溶出液与制备的含有个体数量密度的小球藻的超纯水，以任意比例混合的混合液加入到试验容量的75vol%。这样，全部试样的最终的CA培养基成分浓度与表2所示的值相同，根据炉渣溶出成分的元素，浓度不同。在此，将不含炉渣溶出液仅CA培养基的条件称为控制条件。

将含有渣溶出液的CA培养基和小球藻放入塑料制管中，温度（23±2）℃，在每12h明暗周期的白色荧光灯下（约1100Lux）培养一周。小球藻（试验开始时的小球藻个体数量密度为1.0×10⁴细胞/ mL）悬浮使用。培养一周后，用血球计算板法测定各条件下的小球藻个体数量。小球藻的增殖率，用含有炉渣溶出液条件下的小球藻增殖数与不含炉渣溶出成分的小球藻增殖数的百分比（平均值±标准误差）表示。

2.2.3 用流式细胞术法的评估

为了分析含有炉渣溶出液CA培养基中的小球藻细胞状态，采用了使用毛细管型流式细胞仪的流式细胞术（FCM）法。使用的装置配备了直径100μm超细毛细管，对以0.59μL/s的流速通过毛细管的各个小球藻细胞照射532nm的绿色激光，由采用照射产生的荧光，评估细胞状态。该装置配备了680/30nm和576/28nm两种带通滤波器，通过激光照射可以检测到激发的黄色或红色荧光。

外部不施加应力的标准状态的藻类，只观察到来自光合成色素的叶绿素的强烈的红色荧光。而采用加热处理的外部应力，在死亡的个体中，可以观察到叶绿素生物降解导致的红色荧光减少与黄色荧光相对增加。本研究中，用FCM法分析了炉渣溶出成分存在下培养的小球藻（渣溶出液的最终浓度为50vol%）的细胞状态，由波长665-695nm的红色荧光强度和波长562-590nm的黄色荧光强度组成的两维展开图的变化，分析了小球藻每个个体的应力程度。以受应力的小球藻为标准试样，制备了将小球藻用5min加热到100℃的热处理试样作为比较用试样。并将不含小球藻的CA培养基检测的微弱信号，作为培养液杂音区域的信号，从分析中排除，将非杂音区域作为来自小球藻的信号进行了分析。

2.3 炉渣溶出成分对可溶性碳酸化学物种浓度的影响

2.3.1 炉渣成分溶出液中的碳酸化学物种的测定

可溶性二氧化碳（CO₂（aq））对于包括浮游植物的水中光合成生物很重要。因此，本研究中不仅调查了渣中溶出的各元素浓度，而且还调查了炉渣溶出成分存在下的CO₂（aq）浓度。为了直接检测CO₂（aq），使用了傅立叶变换红外光谱仪（FT-IR）。测定采用了使用金刚石为晶体的全反射（ATR）法。在此，作为水溶液中含CO₂（aq）的标准试样，制备了将0.5mol/ L NaHCO₃、0.5mol/L HCl和超纯水分别以一定比例混合的混合液。将来自该标准试样中CO₂（aq）的红外吸收特定波数作为CO₂（aq）指标。

除FT-I R的 CO₂（aq）定性分析外，还用隔膜式二氧化碳电极定量分析了CO₂（aq）浓度。

2.3.2 添加钙和镁化合物的溶液中总二氧化碳量的变化

将作为炉渣溶出成分设定的Ca（OH）2和MgO，以任意浓度混合在CA培养基中，用隔膜式二氧化碳电极测定了总碳酸量。此时，与上述的小球藻增殖试验一样，最终将混合液制备成CA培养基的成分如表2所示的组成。

2.3.3 培养前后的Ca² 和Mg² 浓度的变化

Ca² 和Mg² 浓度也可作为水质硬度指标利用，两种元素是容易与碳酸化学物种反应的因子。为了研究这些元素对炉渣溶出液中的CO2（aq）浓度的作用，跟踪了小球藻培养前后培养基中的Ca² 和Mg² 浓度的变化。将小球藻在含有炉渣溶出成分的CA培养基中培养一周后，离心培养容器，使小球藻沉淀，只回收培养上清，将该培养上清用于元素分析。在培养基中，除无机盐外，还含有维生素等有机物（见表2）。纯水中的元素浓度用ICP-AES或ICP-MS分析。生物试样等中的有机物会干扰这些测定。因此，为了测定培养上清中的Ca² 和Mg² 浓度，本研究采用螯合剂的比色定量法。具体方法是，回收的培养上清中的Ca² 浓度基于偶氮氯膦Ⅲ（Chl or ophosphonazo-III）和Ca² 离子的螯合物形成产生的颜色，测量690nm吸光度进行比色定量。Mg² 浓度基于Xyr idyl Bl ue-Ⅰ和Mg² 离子的螯合物形成产生的颜色，测量660nm吸光度进行比色定量。再用t-检验，比较培养前后两种元素的浓度，判断是否存在统计学上显著的差异。

3 结果及分析

3.1 炉渣溶出成分的主要组成

表3是试验使用的电炉氧化渣溶出液中各成分的浓度。此外，表3中还示出了以溶出试验为目标的土壤污染和作为参考值的水质污染的环境标准。试验使用各炉渣的主要成分中，发现Ca、Mg和Si等溶出。但相对的Al、Fe没怎么溶出。溶出试验的结果，试验使用的两种渣溶出的各元素浓度，A渣溶出的硒超过了土壤标准，但其他则在土壤污染的环境标准值范围以内。

3.2 炉渣溶出成分对小球藻影响的评估

3.2.1 炉渣溶出成分对小球藻增殖的效果

图1是小球藻增殖率与水溶液中炉渣溶出成分浓度的关系。从整体看，炉渣溶出成分含量在30vol%以下，小球藻的增殖率随着炉渣溶出浓度增加。而在30vol%以上的浓度，若根据表示标准误差的误差棒宽度判断，基本恒定不变。如果在溶出液之间比较，溶出液浓度为50vol%以下，A溶出液和B溶出液的增殖率基本

上接B10版

相同。溶出液浓度为70vol%时，添加B溶出液的一方小球藻的增殖率比添加A溶出液稍高。

图2是小球藻的增殖率与水溶液中钙浓度的关系。本试验中，CA培养基成分的浓度是恒定的。而且，CA本身也含有钙，所以下限从约3.4mg/ L开始标记。Ca浓度增加与炉渣溶出液浓度增加的意义相同，所以Ca浓度增加与增殖率的关系与图2的渣溶出液浓度与增殖率的关系类似。

3.2.2 炉渣溶出成分存在下的小球藻的细胞状态

将FCM法获得的各个小球藻细胞的红色荧光强度与黄色荧光强度的光学特性绘制在平面上，如图3所示。图中的一个点表示单个细胞。在控制条件中，小球藻主要由红色荧光强度10²-10³向黄色荧光强度10¹-10²分布，与黄色荧光的相关性低，为向依存红色荧光的上方延伸分布。加热处理的小球藻，主要呈由红色荧光强度10¹-10²向黄色荧光强度10¹-10³右上方分布的曲线。此外，含有渣溶出液的溶液中的小球藻分布，虽红色荧光强度比控制条件稍大，但两种分布基本类似。

在图3中，很容易区分小球藻分布。尤其是将判断生死作为主要标准进行了以下区分。区域Ⅰ为活的健康的小球藻的主要存在区域。而区域Ⅱ是加热处理导致细胞死亡或不健康的小球藻主要存在区域，作为细胞死亡的指标。除此以外，区域Ⅲ是红色荧光强度低的区域。区域Ⅳ是作为小球藻几乎不存在的区域分配。但是，区域Ⅲ，即使不施加外部应力控制条件也极少检测出小球藻，认为经过长期的连续性培养，由于培养基中的营养成分不足，存在一部分死亡的小球藻，或者是含有极少的噪音的区域。表4是各处理条件下各区域的小球藻数量的比例。如果基于上述区分判断，控制条件中的小球藻分布和加热处理的小球藻分布存在明显差异。此外，即使在炉渣溶出成分存在下，小球藻基本分布在区域Ⅰ。视为健康小球藻的区域Ⅰ的小球藻存在比例是，控制条件是96.81%±2.60%；A溶出液是98.15%±0.31%；B溶出液是98.13%±0.24%。两种溶出液与控制条件相比，小球藻的存在比例稍高。因此，即使含有炉渣溶出液，健康的小球藻的存在比例与控制条件相比，为同等以上，可以说炉渣溶出成分对小球藻不构成直接的应力因素。炉渣溶出液中含有CA培养基中没有的铜、锌，还有作为植物生长抑制因子的铝。但这些元素如溶出液一样复合存在，对小球藻的增殖没有直接影响，对小球藻也没有明显的毒性。

3.2.3 炉渣溶出成分使可溶性CO₂浓度增加

通过研究可知，炉渣溶出成分对小球藻没有明显的毒性。那么为什么小球藻比控制条件增加尚不明确。植物和藻类的光合成生物的生长和增殖在很大程度上依存于光合成效率。光合成可以分为依存光的明反应和通过固定CO₂合成糖的卡尔文循环两种。本研究中光条件固定，所以关注了与卡尔文循环有关的CO₂。

作为含有CO₂（aq）的标准试样，在准备的NaHCO₃和HCl混合液中，依存两者的浓度比，基于式（1）产生CO₂（aq）。

NaHCO3 HCI→NaCl C O₂[aq] H₂O （1）

该CO₂（aq）用FT-IR法可作为2350cm^-1附近的红外吸收波检测，该波数相当于基于CO₂反对称伸缩的红外吸收波。在本研究中，为了研究炉渣溶出成分导致的小球藻增殖与光合成相关的CO₂（aq）量的关系，用FT-IR法直接检测出含有炉渣溶出液的CO₂（aq）。检测结果表明，含有炉渣溶出液的试样显示CO₂（aq）量高。在此，根据用隔膜式二氧化碳浓度计测定的炉渣溶出液存在下的总二氧化碳量，定量比较了各条件下的CO₂（aq）浓度。含有炉渣溶出液的CA培养基的pH值与CA培养基的pH值（7.2）基本相同。总二氧化碳量的测定值，由各试样的pH值和Hender son-Hassel bal ch方程式计算CO₂（aq）浓度的结果，与控制条件相比，含有炉渣溶出成分的混合液的CO₂（aq）浓度高。B溶出液比A溶出液的CO₂（aq）浓度高。因此，添加炉渣溶出成分，在CO₂（aq）增加这一点上，给小球藻提供比控制条件更适合光合成的水环境，认为这与小球藻的增殖有关。图1中添加B溶出液一方小球藻的增殖率比添加A溶出液稍高，这也可以说明因A溶出液与B溶出液的CO₂（aq）量不同。

3.2.4 炉渣溶出成分导致可溶性CO₂浓度增加的意义

在藻类细胞中，CO₂（aq）浓度增加可促进光合成的碳酸同化作用。但是，在现在大气中的CO₂（aq）浓度中，溶解在水中的CO₂（aq）浓度相对低，因此，CO₂（气体）浓度被认为是限制光合成的主要因素。这不仅适用于直接利用CO2（气体）的陆地植物，而且对于利用水域中CO₂（aq）浮游植物等光合成生物也同样重要。实际上，本研究在炉渣溶出成分存在下的总二氧化碳量的增加，与潜在的CO₂（aq）浓度上升有关，最终使小球藻数量增加。

综上所述，炉渣溶出到水中的成分，对小球藻没有显著的毒性。在水环境中，可以使控制光合成生物主要因素的CO2（aq）浓度上升。从这一点可以认为，在水域中使用炉渣，对支承水域生态系统的浮游植物有益。另一个意义是，由此诱导的生态系统的生产者光合成生物数量增加，这就有可能增加我们的主要食材海产品的收获量。本研究中，作为浮游植物和水域的光合成生物的模型生物，只用小球藻进行了试验。为了更明确显示炉渣溶出成分对水域生态系统的有益性，还应该对小球藻以外的构成水域生态系统的光合成生物做进一步研究。

4 结论

按照JIS K0059-1的规定进行了电炉氧化渣的溶出试验，评估了由试验获得的含有炉渣溶出成分的溶液对绿藻小球藻的影响，得出以下结论。

1）炉渣溶出液满足了土壤污染的标准要求。此外，除了A渣的硒外，也满足了饮用水的标准要求。

2）炉渣溶出成分有助于小球藻的增殖。相对于CA培养基，如果溶出液达30vol%以上，可充分评估炉渣溶出液对小球藻的增殖效果。

3）除了采用血球计算板法的小球藻增殖评估外，还采用了FCM法，如果使用由波长562-590nm的黄色荧光强度和波长665-695nm的红色荧光强度构成的二维图，可以区别健康的小球藻和受到应力的小球藻。该系统作为评估叶绿体中的光合成色素的荧光变化系统，所以，也可能对小球藻以外的其他光合成生物发挥功能。

4）小球藻的增殖不是因为炉渣溶出液中成分直接作用于小球藻，而是与添加溶出液使CO₂（aq）量增加，以及伴随的光合成效率上升有关。

5）炉渣溶出成分使CO₂（aq）量增加，有Ca² 和Mg² 等第二主族元素化合物的作用。 （全荣）